01  非生物风化

80℃黑暗中风化6个月后，LDPE塑料颗粒氧化变成橙黄色，通过FITR检测发现出现羰基峰，分子量也减小。风化引起解聚，聚合物氧化链会断裂。相比于原始的LDPE塑料，风化后的塑料产生大量溶解碳，如图1所示。

图1  原始和风化聚乙烯的非生物风化和碳浸出

02  在原始和风化PE中孵化时的生长

分别在含琥珀酸、原始LDPE 、风化LDPE和不添加碳源的培养基中接种Alcanivorax sp. 24，令人惊讶的是，从风化PE中浸出的约180 ppm碳（从图1c推断的数据）诱导的初始生长速率高于不稳定基质琥珀酸盐。然而，随着时间的推移，由于琥珀酸盐条件下可获得1200 ppm的碳，Alcanivorax sp.24实现了预期的更高细胞产量。无碳或原始LDPE颗粒的生长可以忽略不计（图2b）。

Alcanivorax sp.24在存在原始PE和风化PE的情况下生长，获得了塑料的同位素特征，证实该菌株不仅能够吸收风化PE的渗滤液，而且能够从原始PE中获得碳。Alcanivorax 的同位素特征（δ¹³C）来自于与原始和风化的IAEA-CH-7 PE膜孵育七天的培养物（即检查其同位素均匀性的材料，δ¹³C值为−32.15‰±0.05‰）。用琥珀酸和无碳源培养的细胞作为对照。以化石燃料为基础的材料，如聚乙烯，因其¹³C耗尽而闻名，因此其δ¹³C值低于−30‰，而从C₄植物中获得的琥珀酸盐的¹³C含量更高，δ¹³C值在−13‰左右。在原始PE和风化PE中生长的Alcanivora 的同位素值与标准PE材料的同位素值几乎相同，表明细胞获得了塑料的同位素¹³C:¹²C比（图2c）。正如预期的那样，在琥珀酸盐存在下生长的Alcanivorax 的δ¹³C特征不那么负（−16‰）。从没有添加碳的培养物中提取的饥饿细胞似乎保留了它们最初使用的基质的同位素比例。

图2  Alcanivorax sp.24在原始和风化PE上的生长

03  降低原始LDPE的质量和聚合物分子量分布

鉴于意外观察到Alcanivorax 获得了原始PE的同位素特征，我们进一步研究了该细菌是否能够对塑料进行物理化学修饰。风化和非风化LDPE膜在Alcanivorax sp.24培养基中培养34天，然后测定质量变化（图3）和聚合物总分子量（表1）。

表1  在Alcanivorax sp.24存在和不存在的情况下培养34天的原始和风化LDPE膜的聚合物分子量分布

有趣的是，Alcanivorax 使原始LDPE膜的中值质量减少了约0.9%，而奇怪的是，对照组（即未接种和死细胞对照组）的中值质量增加分别为约2.1%和约1.7%（图3）。浸没塑料的质量增加并不意外，可以通过材料内的膨胀水化和/或盐沉积来解释。风化LDPE膜的平均质量损失约为2.4%，与Alcanivorax 的存在无关（图3）。该质量损失与根据风化聚乙烯释放的溶解有机物（即约2%）计算的值一致，该值可能以微生物生物降解的现成低聚物的形式存在。Alcanivorax sp.24降低了原始LDPE的聚合物重量分布（表1）。细菌的存在将原始LDPE的分子量从122900减少到83500，将风化LDPE的分子量从24100减少到20600。原始LDPE的Mn、Mw和Mz的还原率分别为20.1%、32.0%和44.7%，风化LDPE的还原率分别为55.0%、14.7%和28.4%。这种广泛的解聚作用再次表明Alcanivorax sp.24能够对原始和风化的LDPE进行物理化学改性。因此，初级PE生物降解的分子机制值得进一步研究。

图3  34天后，在Alcanivorax sp.24存在和不存在时的LDPE膜质量变化

04  通过蛋白质组分析法研究对PE存在的应答

通过蛋白质组学分析Alcanivorax sp.24对原始和风化LDPE膜存在的分子反应。分析包括浮游细胞和附着在PE上的生物膜，后者由于与基质直接接触，有望提供更强的信号。这一全面的蛋白质组分析与Alcanivorax sp.24的蛋白质组分析相辅相成，Alcanivorax sp.24生长在中链和长链烷烃（C₁₆；戊烷，C₂₅；戊烷，C₅₀）以及短链和中链二羧酸（即琥珀酸，C₄；十六烷基二酸，C₁₆）上，所有基质都可能来自PE风化。Hakkarainen和Albertson（Hakkarainen和Albertson, 2004）发现了200多种非生物PE氧化产生的脂肪族降解产物，Eyheraguibel及其同事（Eyheraguibel等人，2017）最近描述了1320种高度氧化的低聚物，即烷烃、烯烃、酮、醛、醇、羧酸和二羧酸、内酯、酮酸和酯类。在这些脂肪族基质中，羧酸最稳定，因此在长时间的风化过程中容易积累，而其他产物，如醛、酮和醇，则进一步氧化为羧酸。条件之间的总体比较显示，从不稳定基质到稳定基质存在梯度，即琥珀酸是最不稳定的基质，其次是烷烃C₁₆和C₂₅以及十六烷基二酸。在Alcanivorax 的更顽固的底物中，我们观察到原始的PE和长烷烃C₅₀，其次是风化的PE（其中浮游生物和生物膜生长的细胞的蛋白质组非常紧密地分组）。在原始PE作为碳源的情况下，观察到浮游生物和生物膜生长的细胞之间有更强的分化，这表明直接附着在PE上的细胞可能更容易接触到这种顽固性基质（图4）。因此，PE作为异养细菌细胞碳源的可及性似乎受到PE热氧化以及Alcanivorax 黏附在材料表面的强烈介导。

图4  不同处理下生长的Alcanivorax sp.24产生的蛋白质组数据的主成分分析

所有处理与琥珀酸盐（对照）生长之间的比较蛋白质组学使我们能够确定Alcanivorax 用于特异分解中链和长链烷烃以及中链二羧酸（即十六烷基二酸）的细胞过程，并将其与菌株在原始和风化PE中生长时的细胞反应进行比较。有趣的是，当在中链和长链烷烃或十六烷基二酸存在下生长时，一些蛋白质显示出更高的丰度，但这些蛋白质在PE处理中均上调（图5），证实了Alcanivorax 编码的代谢多功能性，以分解PE链氧化和断裂产生的脂肪族化合物的复杂混合物。

05  烷烃氧化

羟基化是烷烃同化的第一步。短链和中链烷烃被烷烃单加氧酶AlkB末端羟基化。Alcanivorax sp.24编码三种AlkB酶，即使在存在原始PE的情况下，其在大多数烷烃和PE处理中的表达也显著增加。长链烷烃（例如C₅₀）的同化目前尚不清楚，有研究者假设长链烷烃的氧化可能在底物亚末端羟基化后完成，然后通过Baeyer-Villiger单加氧酶AlmA将亚末端羟基化烷烃转化为酯，再由酯酶进一步水解。有趣的是，AlmA在所有PE处理中表现出最强的增长，这可能是PE生成长链烷烃的结果。正如所料，在十六烷基二酸处理中未观察到AlmA和AlkB酶丰度的增加，这表明这些途径受到Alcanivorax sp.24中烷烃的存在的严格调控。

图5  Alcanivorax sp.24用于摄取和降解脂肪族底物的代谢途径模型

06  脂肪酸降解模型

羟基化烷烃进一步氧化为脂肪酸，并通过β-氧化途径降解。图5显示大量脂肪酸降解酶分配给某些底物组的尝试：以脂肪酸形式漏斗状排列的中型和大型烷烃，以及中型二羧酸。有趣的是，这些酶在PE处理中均上调，另外一组酶仅在塑料存在时上调，作者认为它们参与降解更复杂的脂肪族化合物，例如不饱和和亚末端氧化以及支链、奇数和大脂肪酸。因此，PE降解产生的产物最终转化为醋酸盐，并进入TCA循环，用于碳同化和能量生成。

07  初级PE链断裂

与短链和中链烷烃不同，长链和超长链烷烃（如PE中的烷烃）的生物结合似乎是不现实的，聚合物链断裂是跨生物膜运输所必需的。虽然形成PE主链的C-C键高度稳定且无反应，但PE氧化会产生较弱的酶断链位点。脂肪族化合物的存在诱导了Alcanivorax sp. 24中脂肪酶和水解酶的上调。虽然大多数水解酶（即ALC24_0035、1429、1581、2299和4209）被预测为细胞质，因此可能在进口低聚物的生物降解中发挥作用，但酶ALC24_1162、2550和3988可能分泌到周质或外膜，在那里它们可以水解氧化的PE链，降低其分子量并促进其生物同化（图5）。

08  产生氧化LDPE膜表面的细胞外活性氧

众所周知，海洋微生物可产生细胞外活性氧，尤其是超氧化物（推测是引发PE链断裂和降解的主要途径）。因此，我们测量了Alcanivorax sp.24在不同底物存在下生长14天后产生的细胞外活性氧（图6a）。有趣的是，虽然在大多数情况下，在最初24小时的培养过程中观察到超氧物生成的峰值，但在整个两周的培养过程中，原始LDPE诱导Alcanivorax 产生的ROS较低但延长了很多（图6a）。经风化PE培养后，超氧物的生成水平可以忽略不计，这可能是由于细菌产生的ROS较低，或由于塑料渗滤液可能具有猝灭作用，即与超氧物快速反应，不允许其氧化荧光素报告物。

图6  Alcanivorax sp.24培养物中ROS的产生和LDPE膜表面氧化

在用Alcanivorax 培养的原始LDPE膜中检测到氧化峰（图6b上的绿色箭头）表明，细菌产生的活性氧实际上可能影响聚合物的物理化学。该氧化峰发生在热氧化非生物诱导羰基形成的相同波数处。

09  总 结

总之，我们的数据为PE生物降解提供了关键的新见解。Alcanivorax sp.24在分解PE降解产生的脂肪族基质的复杂混合物方面表现出令人印象深刻的代谢潜力，当细菌暴露于风化和原始PE时观察到这一点。这种代谢途径的诱导以及塑料同位素特征的获得表明，细菌可以有效地利用从这种材料中渗出的少量基质，或其本身可以引发原始PE的链断裂，即，如所测试的原始和风化LDPE材料的质量损失和广泛解聚所示，原始PE的主链断裂可能通过细胞外活性氧的产生和高分子量PE聚合物的非特异性链内氧化发生。需说明的是该研究是在最佳的实验室条件下进行的纯菌培养，无法确定复杂生物和换几个是否会对碳氢化合物的降解产生影响，还需进一步的研究证实。